Цисплатин

Після пошкодження ДНК цисплатином у клітинах відбувається збільшення експресії білка Р53 і Р53-залежне підвищення експресії білка р 21, який і спричиняє зупинку клітинного циклу [21].

Субтокичні дози цисплатина індукують загибель клітин за типом апоптозу, з усіма характерними біохімічними та морфологічними ознаками процесу: екстерналізацією фосфотидилсерину, активацією каспаз, фрагментацією ДНК, утворенням апоптичних тілець [22-24].

В багатьох модельних системах in vitro показано, що лікарські протипухлинні препарати, в тому числі і цисплатин, викликають підвищення експресії поверхневого рецептора Fas, що потребує синтезу білка de novo [25], а також його ліганда FasL [26]. Але на сьогодні вважається, що індукований проитипухлинними ліками апоптоз не є залежним від активації безпосередньо Fas-системи, оскільки вживання антагоністичних анти-CD95 моноклональних антитіл не впливало на розвиток апоптозу під дією цитостатиків [27].

Особливо цікавими є дані щодо ефекторних механізмів апоптозу, індукованого цисплатином. Відомо, що у цьому процесі бере участь каспаза-3, оскільки застосування її інгібіторів білка CrmA та Z-VAD-CH2DCB призводить до гальмування апоптозу, спричиненого цитостатиком [28,29]. Каспаза-3 активує інші каспази, крім того розщіпляє фактор ініціації трансляції 4G (eIF4G), що призводить до гальмування синтезу білка [30].

4.Механізми резистентності пухлинних клітин до цисплатина.

4.1.Механізми клітинної резистентності на рівні цитоплазматичної мембрани

Одним з основних механізмів клітинної резистентності до цисплатина розглядають особливості будови цитоплазматичної мембрани та прямого та зворотнього транспорту крізь неї.

Однією з особливостей пухлинних клітин, резистентних до дії цисплатина, є зменшена у порівнянні з чутливими клітинами акумуляція препарату [31,32].

Дана модель пояснює, чому так багато клітинних ліній резистентних до дії цисплатина відрізняються зменшеним накопиченням цисплатина. Мутації, що призводять до змін структури каналів чи гіперполяризації клітинної мембрани, можуть спричинити виникнення резистентного клона клітин.

Нещодавно до клітин мишиної лімфоми R1.1, резистентних до дії цисплатина були одержані антитіла, які реагували з глікопротеідом з молекулярною масою 200кД, гіперекспресованим на поверхні цих клітин. Кількість білка на клітинній поверхні знаходилась у зворотній залежності від акумулювання цисплатина у клітинах та корелювала з рівнем їх чутливості до цисплатина. Було запропоновано, що даний білок може бути аналогом Р-глікопротеіда (Pgp) і є непрацездатним каналом, що гіперекспресований на клітинній поверхні для компенсації дефектної функції [33].

В резистентних до цисплатина клітинах з підвищеним вмістом глутатіона часто спостерігається гіперекспресія ГS-Х-помпи. В цитоплазматичних везикулах таких клітин знаходиться більше кон`югатів ГS-Pt, ніж в чутливих клітинах [34]. Така внутрішньоклітинна компартменталізація ліків та продуктів їх метаболизму також вважається одним з механізмів лікарської резистентності. В багатьох випадках резистентні пухлинні клітини відрізняються розвинутою везикулярною сіткою, що дозволяє їм просторово нейтралізувати токсини та виводити їх шляхом екзоцитозу.

В експериментах з використанням бутионінсульфоксиміна (BSO), інгібітора синтезу глутатіона, було показано, що при витощенні внутрішньоклітинного глутатіона активність ГS-Х-помпи лише трохи зменшується [35]. Таким чином, ефективність транспорту ГS-Pt-кон`югатів визначається не тільки концентрацією останніх, а й експресією переносника.

Останнім часом з`явилися роботи, що засвідчують, що білок, асоційований з загальною лікарською резистентністю (MRP але не Pgp) може функціонувати як ГS-Х-помпа [36,37]. Ця гіпотеза підтверджується такими фактами: 1) клітини, що гіперекспресують MRP секретують у культуральне середовище більше глутатіона; 2) витощення внутрішньоклітинного глутатіона за допомогою BSO запобігає виведенню ліків з клітин за допомогою MRP; 3) гіперекспресія MRP відповідає підсиленому АТФ-залежному транспорту кон`югатів ГS-Х; 4) антитіла до MRP реагують з білком з молекулярною масою 190 кД, який може зв`язуватись з ГS-кон`югатами та лейкотрієном С4.

Таким чином, видалення з клітин комплексів глутатіон-S-платина переносниками з активністю ГS-Х-помпи є важливим механізмом резистентності, завдяки якому внутрішньоклітинна концентрація препарату підтримується на низькому рівні, що сприяє зменшенню його пошкоджуючого ефекту.

4.2.Внутрішньоклітинні тіолові детоксикуючі системи

4.2.1. Система глутатіона

Глутатіон та ферменти його метаболізму є важливими елементами меxанізму резистентності клітин до алкілуючих агентів, в тому числі сполук платини.

Більшість клітинних ліній, резистентних до дії цисплатина відрізняються підвищеним вмістом внутрішньоклітинного глутатіона та/чи гіпреактивністю фермента, що ініціює синтез глутатіона g-глутамілцистеінсинтетази (g-ГЦС) [38-40]. Однак описані приклади стійких до дії цисплатина клітинних ліній з нормальним [41,42] та зниженим [43] у порівнянні з чутливими лініями вмістом глутатіона.

Сучасні стереоскопічні та спректроскопічні методи дозволили визначити, що глутатіон та цисплатин реагують безпосередньо у безклітинній системі в молярному співвідношенні 2/1, утворюючи хелатний комплекс диглутатіонплатини. Після 12 годин інкубації клітин в середовищі з цисплатином концентрація ГS-Pt-кон`югатів стає максимальною. При цьому 60% внутрішньоклітинної платини знаходиться у зв`язаному стані [10].

Заслуговують на увагу дані, отримані в експериментах з використанням інгібітора синтезу глутатіона бутіонінсульфоксиміна (BSO). Обробка BSO клітинних ліній раку шлунка людини MKN-28 та MKN-45 , раку яєчника КК та МН, аденокарциноми ротової порожнини КВ призводить до сенсибілізації клітин до дії цисплатина [44,45]. Причому витощення внутрішньоклітинного глутатіона за допомогою BSO не впливало на акумулювання цисплатина в клітинах а також формування кон`югатів GSH-Pt [46].

При вивчeнні взаємодії ферментів метаболізму глутатіона та їх ролі в механізмах резистентності велике значення мають експерименти з використанням культур клітин, трансфекованих генами відповідних ензимів. Наприклад, клітини раку легенів людини, трансфековані геном фермента g-ГЦС, мають у 2 рази більше глутатіона, в 1,6 рази підвищену активність ГS-Х-помпи та в 1,5 рази меньшу акумуляцію цисплатина, в 6,7 рази більшу резистентність до цисплатина у порівнянні з батьківською клітинною лінією. Витощення внутрішньоклітинного глутатіона в трансфектах за допомогою BSO не впливало на резистентність до цисплатина. У таких випадках зберіглась висока активність ГS-X-помпи і тому внутрішньоклітинна концентрація платини не змінилася. Таким чином, в даній клітинній системі резистентність обумовлена посиленим видаленням ГS-Pt-конюгатів за допомогою ГS-Х-помпи, що не загубила своєї активності навіть при витощенні субстрата (глутатіона) [47].

В той же час не винайдено ніякого зв`язку між рівнем експресії глутатіонредуктази та глутатіонпероксидази та ступенем стійкості клітин до дії цисплатина [48,49].