Механізм інактивації потенціал-залежних К+ каналів

Однак, профіль гідрофобності консервативний, що виходить з припущення про те, що гідрофобні взаємодії визначають стабільність комплексу кулькового пептиду з рецептором. На підтвердження цієї думки, було показано, що цитоплазматичний домен (коли він приєднується в якості химерної частинки) зв’язує сегмент 3 або 4 (мал.1) потенціал-залежних Na-каналів також здатний діяти як інактиваційна частинка для калієвих каналів. 3-4 зв’язок було запропоновано як інактиваційну кульку для Na-каналів. З цих досліджень і було зроблено висновок про те, що рецептор кулькового пептиду може мати негативний поверхневий потенціал, як було попередньо показано для внутрішніх ворітних калієвих струмів, і також обов’язково має мати гідрофобну поверхню, яка здатна взаємодіяти з першою половиною кулькового пептиду. Хоча реакція між кульковим пептидом і ShBD6-46 К+ каналом бімолекулярна, в проміжку часу, який відповідає відновленню від заблокованого стану можна розрізнити два різні стани блоку. Дуже складно пояснити молекулярну природу кожного стану, але з огляду на дуже високий рівень константи зв'язування Q10 в реакції пептиду з каналом, Murrell-Lagnago and Aldrich запропонували гіпотезу про те, що два стани виникають через присутність кількох різних структурних форм пептиду в розчині. Підвищення температури збільшує концентрацію пептиду з правильною структурою для зв'язування.

Isacoff et al. встановили, що мутації в цитоплазматичній петлі, яка приєднує трансмембранні домени S4 і S5 спричинюють дикий тип інактивації в ShakerB і drk1, в яких інактивація індукується додаванням ShakerB - кулькових пептидів з внутрішньої сторони плазматичної мембрани. Відповідаючи дослідженням з кульковим пептидом, гідрофобний залишок має особливе значення для стабілізації інактивованого стану. Мутації цієї ділянки також змінюють властивості йонної провідності, з чого можна припустити їхній близький зв'язок з канальними структурами, через які перебігає йонний струм.

Деякі автори пропонують вважати, що близькість залишків, задіяних в процесі швидкої інактивації до S4 домену може створювати основу тісного зв'язку між активацією та інактивацією. Конформаційні зміни внаслідок вилучення заряджених залишків S4 спіралі можуть збільшувати афінність кульки до її рецептора. На підтримку взаємодії між доменами, задіяними в процесах активації та інактивації, Bozanilla показав, що присутність інактиваційної частинки ShakerB каналів сповільнює переміщення воротних зарядів під час припинення деполяризаційних пульсів. Ці результати змушують думати про можливість конформаційних перебудов, а не просто взаємодію кульки з рецепторами в процесах активації та інактивації.

Механізм блокування кульковим пептидом.

Як зазначалося вище, інактиваційна частинка поводиться схоже на блокатор йонного струму. Це було продемонстровано, використовуючи ТЕА блокатори К+ каналів в гігантському аксоні кальмара. Для того, щоб зрозуміти механізм блокування інактиваційною частинкою, необхідно повернутися до класичної біофізики.

Armstrong встановив, що внутрішньоклітинний ТЕА блокує лише канали у відкритому стані, що пов'язується з думкою про те, що ТЕА глибоко проникає в середину каналів, перекриваючи потік йонів. Така ідея протилежна до думки про можливу алостеричну дію, яку виявляє ТЕА, індукуючи довготривалі конформаційні зміни і порушення провідності йонів через канальні структури.

Виходячи з припущення про локалізацію блокатор-зв'язуючої ділянки, можна прогнозувати, що збільшення йонного струму через канал здатне дестабілізувати взаємодію блокатора з каналами і таким чином пом'якшувати блокаду.

Властивості інактиваційної частинки ShakerB як блокатора відкритих каналів також були продемонстровані.

Demo and Yellen показали, що час відновлення від інактивації (тобто час, потрібний для того, щоб канальний білок повернувся від інактивованого стану до закритого неінактивованого стану) скорочується за присутності високих концентрацій К+ в зовнішньому середовищі. Це узгоджується з ідеєю про "пом'якшення інактивації".

Експерименти з ізольованими каналами підтвердили точку зору про те, що канали інактивуються у відкритому стані. Точніше, для того, щоб інактивуватись, канал спочатку має відкритися, а після приєднання, інактиваційна частинка заважає каналові повернутися до закритої конформації. Отже, просту кінетичну модель актиації можна зобразити таким чиом: С-О-І. Для того, щоб перейти від інактивованого до закритого стану, каналові необхідно відкритися. (мал.2) Інактиваційний ShakerB кульковий пептид поводиться як блокатор відкритих каналів.

Стехіометрія інактиваційної реакції.

З вищесказаного випливає очевидність того, що потенціал-залежні канали - це тетрамери, утворені ідентичними чи змішано - незалежними субодиницями. Коли це так, то кожен канал має 4 незалежні NH2 - кінці, потенційно здатні бути інактиваційними частинами. Скільки їх потрібно, щоб відбулася інактивація?

MacKinnon et al. підійшли до цього питання створюючи субодиничні форми Shaker, в яких присутність інктиваційної кульки була пов'язана з мутацією, що робить канал стійким до блокади СТХ, але не має відношення до інактивації. Цю форму каналу ін'єктували в ооцити Xenopus laevis разом з токсин-нечутливими неінактиваційними субодиницями, і очікувалась експресія тетрамерів з хаотичним випадковим складом. Достатньо лише одного токсин-зв'язуючого сайту, щоб підтвердити чутливість до токсину, коли лише однієї кульки достатньо для інактивації каналу, тоді всі токсин-чутливі канали з вбудованими 1-4 токсин чутливими субодиницями, які несуть кульки, мають інактивуватися.

Насправді, всі швидко інактиваційні компоненти, індуковані ін'єкцією змішаних субодиниць, блокувалися СТХ. Однак інактивація каналів, які містили менше ніж 4 інактиваційні частинки, була повільнішою ніж у тих, які містили всі 4 кульки. Такі дані можна трактувати аналогічно до доза-залежного рівня інактивації ShBD6-46 каналів, на які діяли вільним кульковим пептидом, при чому зростання інактиваційного рівня відбувалося коли пептид був більш позитивно зарядженим. В будь-якому разі припускається, що збільшення концентрації кулькового пептиду біля його рецептора, збільшує вірогідність їхнього зв'язку і відтак - рівня інактивації; тим не менш, лише одна кулька взаємодіє з гирлом каналу.

b - субодиниця швидкої інктивації.

Більшість досліджень молекулярного та біофізичного механізмів швидкої інактивації К+ каналів зосереджувалось навколо NH2 кінцевого домену а- субодиниці канального білку. Однак, деякими авторами було також висловлено думку про те, що білкові домени з інших субодиниць можуть спричинювати швидку інактивацію неінактивованих каналів, коли їх експресувати разом з а- субодиницею.

Retting et al. ідентифікували клони цДНК, які кодують 2 ізоформи В- субодиниць К+ каналів мозку щурів. Коекспресія одного з них КVB1 з мРНК, що кодує RCK1 веде до експресії швидко інактивованого струму, на відміну від експесії самого RCK1, який не інактивується. Так само, коекспресія КVB1 і RCK4 прискорює у 8 разів інактивацію експресованого окремо RCK4.