У 13 ст. інтенсивно провадять місіонерську діяльність на території Малої Русі ченці Домініканського ордену, але без жодних наслідків. Вони обслуговують лише те католицьке населення, яке з'явилося на Малій та Білій Русі вже в 14 ст. в містах, яким українські та литовські князі надавали німецьке (Магдебурзьке) право. В цих містах католики (німці, поляки та ін.) перебували в упривілейованому положенні в порівнянні з руськими (православними). Ягайло та Вітовт збільшували католицьку людність, підтримували старі та заводили нові латинські єпархії та парафії (в Києві, Вільно, Перемишлі, Львові, Луцьку). Дві церкви жили спокійно, кожна сама по собі, й справа з'єднання їх у формі Флорентійської унії не мала ніяких наслідків. Найбільший прихильник такої унії митрополит Ісидор вибрався до Італії, а його наступник і учень Григорій сам мусив був відмовитися від унії в 1458 р. і вмер православним. Мало говорить на користь унії й так званий “Лист митрополита Михаїла до папи Сикста IV” (1476 р.). Оцінювати ці явища церковного життя необхідно з огляду на політичну ситуацію середини 15 ст., бо православне населення від верхів до низів не думало відмовлятися від своєї віри, в противному разі всі спроби унії залишили б по собі виразний слід.
В кінці 16 ст. сталася подія, що внесла розкол і довголітню запеклу боротьбу в лоно православної церкви й українського та білоруського народів; це – Берестейська церковна унія. Їй, звичайно, приділяють багато уваги всі дослідники минулого Польщі та України, причому її пояснюють одні політичними мотивами того часу, інші – непорядками в православній церкві. І той, і другий погляд треба вважати однобоким. Таке складне явище, як Берестейська церковна унія, викликане багатьма причинами як внутрішнього (для церкви), так і зовнішнього характеру. Тут мають місце історичні обставини, соціально-економічці умови, напрям державної політики, культурно-освітній стан православної ієрархії, моральний рівень її, внутрішні взаємовідносини у православній церкві – все це разом зі специфічними особливостями доби та настроєм пануючих чинників Польсько-Литовської держави після Люблінської унії 1569 р. і викликало згадану церковну унію. За думку про неї, не без впливу латинської ієрархії, вхопилися єпископи: луцько-острозький єпископ Кирил Терлецький та львівський єпископ Гедеон Балабан; незабаром останній відстав від тої думки, а замість нього явився володимирсько-берестейський єпископ Іпатій Потій, мабуть, одинокий ідейний прихильник унії. Вони, власне, й провели цю справу, бо тодішній митрополит київський Михаїл Рагоза та інші єпископи були пасивними людьми. Кирил Терлецький та Іпатій Потій поїхали в Рим (1695 р.) і там дали згоду за унію від імені всієї православної церкви. Такий вчинок двох єпископів викликав сильне обурення на Україні-Русі. Прихильники унії зібралися в Бересті для урочистого проголошення єднання з Римом у жовтні 1596 р. Туди ж прибули й православні: єпископ Гедеон Балабан (львівський) і Михаїл Копистенський (перемишльський), багато представників чорного й білого духовенства, братств і поодиноких земель. Православні утворили свій собор під головуванням патріаршого екзарха архімандрита Никифора. Таким чаном, одночасно в Бересті відбувалося два собори – уніатський (що складався тільки з вищого духовенства) і православний, постанови яких були цілком протилежні. Король Сигізмунд ІІІ був на стороні уніатів, визнав їх постанову і проголосив унію з Римом доконаним фактом, а на протести й постанову православних уваги звернено не було. Опираючись на прихильність короля, енергійну підтримку католицького духовенства та польсько-латинського громадянства, архієреї-уніати поволі забирали собі церковні й монастирські маєтки, твориш кадри підвладного їм духовенства, поступово знаходили собі прихильників серед міщанства й серед селянства. Поширення унії викликало безкінечні судові процеси та заколоти в масах. На другого уніатського митрополита Іпатія Потія підготовлявся атентат, який скінчився тільки тим, що в нього було відрубано кілька пальців. У Вітебську місцевий уніатський архієпископ Іосафат Кунцевич настільки настроїв проти себе православних міщан, що вони його замордували (1623). За це Вітебськ було позбавлено Магдебурського права, 19 особам одрубано голови, близько сотні міщан, що втекли від суду, заочно присуджено до смерті, а майно їх забрано до скарбу. Заколоти були і в інших містах. Взагалі між православними та уніатами йшла вперта боротьба, недарма унію названо було “костію роздору”. Перш за все почалася боротьба літературна, з'явилося багато полемічних творів, де одна сторона боронила себе й нападала на другу. З боку православних виступали найкращі вчені сили, й їх твори й досі зостаються цінними пам'ятниками українського письменства, як “Апокрисис” Христофора Філалета, “Тренос” Мелетія Смотрицького, “Палінодія” Захарії Копистенського. Братства видавали ці полемічні твори. Одночасно з літературною боротьбою йшла й боротьба правова, на грунті сеймового законодавства. Тут виявляли сильну акцію православні магнати та шляхта, які нерідко виступали спільно з протестантською шляхтою. На грунті правовому було зроблено дуже багато, бо до половини 17 ст. не проходило жодного сейму, де б не ставилася справа "греків-дізунитів", себто православних, і наслідки були дуже важливі. Так, в 1609 р. православним пощастило юридично одмежуватися від уніатської ієрархії, а в 1632-34 рр. православні добилися своєї власної, визнаної державою (упривілейованої) ієрархії з київським митрополитом Петром Могилою на чолі. Йому підлягали єпархії: Луцька, Львівська, Перемишльська, Холмська та новоутворена Білоруська.
Верстви світського православного населення особливо енергійно боронили свою віру; виразником настроїв мас у цьому відношенні було козацтво. Воно завжди відстоювало інтереси православної церкви, і там, де впливи козацтва були сильні, себто на Україні, унія не мала успіху. Завдяки козацтву в Києві уніати обмежилися тільки Видубицьким монастирем, а Лаври не могли захопити. Завдяки козакам і Петру Сагайдачному єрусалимський патріарх Феофан в 1620 р. поновив православну ієрархію з митрополитом Іовом Борецьким на чолі. Нунцій Торрес свідчить, що козаки своїми проханнями, погрозами та збройно перешкоджали поширенню унії. У 1632 р. вони через депутацію до сейму відстояли права своєї церкви.
З кінця 17 ст., коли більшість шляхти під впливом політичних та соціально-економічних обставин після 1654 р. перейшла на бік латинства, православні братства підупали, а козацтво, відігравши свою історичну роль, втратило своє значення, – тоді православна церква, зоставишся без своїх проводарів та оборонців, позбавилася своєї ієрархії. На унію перейшла в Західній Україні більшість народних мас. Багато шкодило тоді православ'ю і те, що після 1654 р. частина Київської митрополії опинилася в межах Московської держави, а частина залишилася в Польсько-Литовській державі. Наші митрополити Сильвестр Косів (1647-1657), Діонисій Балабан (1657-1663) та Іосиф Нелюбович-Тукальський (1664-1675) не співчували Москві, і коли та розпочала заходи, щоб підвернути українську церкву під владу московського патріарха, вони стали на бік Польщі. Живучи на території останньої, зазначені митрополити не мали можливості керувати церковними справами Лівобережної України, а тим часом Москва добилася зміцнення своїх виключних впливів і на церковні справи в Польщі. В 1685 році вона за допомогою турецького уряду вирвала в константинопольського патріарха Діонисія IV згоду на те, щоб Київська митрополія перейшла під канонічну залежність до московського патріарха, який благословив на київського митрополита колишнього православною луцького єпископа князя Гедеона Святополк-Четвертинського.