В 1663 р. Мазепа повертається на Україні до батька, мабуть вже хворого, допомагати в маєткових та господарських справах, які вимагали тоді особливої уваги. Але він тримає зв'язок з польським урядом та королівським двором і в 1665 р. дістає звання чернігівського підчашого.
Є відомості, що деякі двірські інтриги й романтичні пригоди його особистого життя перервали кар’єру Мазепи. Але, на думку вчених, вірогідніше це сталося в зв’язку зі смертю королеви Марії-Людвіки (1667 р.) і зречення Яна-Казиміра (1668 р.).
Наприкінці 1669 р. Мазепа вступає на службу до гетьмана Петра Дорошенка. Це був переломний момент у житті і діяльності майбутнього гетьмана, який з того часу цілковито віддає себе українській державній справі. Разом з тим, перехід до Дорошенка, який висунув широку програму відродження самостійної і соборної Української держави, неминуче й остаточно відриває Мазепу від польської політики.
Та передусім поява Мазепи при чигиринському гетьманському дворі була пов’язана з великою зміною в його особистому житті. Приблизно в 1668-1669 рр. він одружився в Корсуні з вдовою Ганною Фридрикевич. Майбутня гетьманова була донькою хмельничанина Семена Половця, білоцерківського полковника, згодом генерального обозного й генерального судді в гетьмана Петра Дорошенка. Її перший чоловік, шляхтич Самійло Фридрикевич, полковник польської служби, який перейшов на козацький бік, був також білоцерківським полковником і генеральним осавулом. Обидва були близькими товаришами Петра Дорошенка, і шлюб Мазепи з Ганною Фридрикевич відкривав йому безпосередній шлях до дорошенківського Чигирина. Невідомо чи мала Ганна дітей від Мазепи, але якщо вони й були то померли в ранньому дитинстві.
У Дорошенка Мазепа був ротмістром надвірної корогви (командиром гетьманської гвардії), а згодом, близько 1674 р., виконує обов’язки генерального осаула. Він брав участь в 1672 р. у війні Дорошенка як союзника Туреччини проти Польщі. Хоч Мазепа був новою й не зовсім своєю людиною в чигиринських керівних колах, на перешкоді стала його попередня діяльність, пов’язана з Польщею, але його роль в Чигирині була значно більша, ніж його офіційний службовий стан. Він не був генеральним писарем, відомість про це була спростована ще самим Дорошенком, але Дорошенко не міг не оцінити великих здібностей Мазепи і не раз доручав йому важливі дипломатичні місії.
Основною віссю зовнішньої політики Дорошенка була спілка з Туреччиною, і це дало можливість Мазепі отримати знання турецько-татарського світу, яке стало йому пізніше у нагоді. На початку 1673 р. Мазепа їздив послом до Криму. Весною 1674 р. Дорошенко посилає його до Переяслава для переговорів з гетьманом Іваном Самойловичем і московським головнокомандувачем князем Г. Ромадановським у справі об’єднання Правобережної України з Лівобережжям. Того ж року Дорошенко відправив Мазепу до Криму й Туреччини, давши йому татарський ескорт й кілька полонених козаків з лівобережжя, призначених у подарунок ханові й султанським достойникам. Під час цієї подорожі, десь біля р. Інгулу, Мазепа попав до рук запорожців, які були б його вбили, якби не кошовий отаман Іван Сірко, що впізнав Мазепу і врятував його.
Коли Самойлович дізнався про це, він зажадав у Сірка віддати Мазепу. Сірко спочатку відмовився, але під тиском московського уряду змушений був віддати Мазепу до Батурину в 1674 р.
Почалася нова й вирішальна доба в житті Мазепи. Хоч він потрапив на Лівобережжя проти своєї волі, але це було не випадково. Правобережна Україна на той період потерпала від руїни, і конала у побоїщах і згарищах, і новий осередок українського державно-національного життя зростав на Лівобережжі. У творенні лівобережної гетьманської держави найактивнішу участь беруть визначні представники правобережної козацької старшини, які зневірилися в політиці Дорошенка, й масово перейшли за Дніпро в 1670-х роках. Лизогуби, Кандиби, Гамалії, Ханенки, Кочубеї, Скоропадські, врешті, Дорошенки і багато інших правобережних фамілій по волі здобувають собі керівні місця в економічному та політичному життя Лівобережжя, куди вони принесли свій господарський та адміністративний досвід, прагнення до стабілізації громадського життя й зміцнення української державності, а разом з тим і прагнення до української соборності.
Серед них був і Мазепа, який незабаром висувається на одне з перших місць в українському уряді і в його відносинах з Москвою.
Мазепа відразу зорієнтувався в новій ситуації. Він здобув собі довір’я Самойловича, який зробив його гетьманським дворянином і доручив керувати вихованням гетьманичів. Це ставило Мазепу у близькі стосунки з гетьманською родиною, з якою він згодом посвоячився.
Мазепі пощастило і у відносинах з Москвою, куди його послав, на вимогу московського уряду, зі своїми рекомендаціями Самойлович. Мазепа справив гарне враження на керманичів московського уряду й одержав «государево жалованье». Шлях до службової кар’єри і здійснення власних політичних планів Мазепи був відкритий.
Як близька людина до гетьмана, Мазепа був в курсі усієї політики уряду Самойловича. Він бере участь у чигиринських походах Самойловича, що намагався утримати Правобережну Гетьманщину під булавою лівобережного гетьманату. Коли руїна Правобережної України перекреслила цей план, Мазепа підтримує прагнення Самойловича поширити владу на Слобідську Україну, куди переселилась значна частина населення Правобережжя. Саме Мазепі і своєму небожу Михайлу Самойловичу доручив Гетьман вести переговори з Москвою про цю справу, але московський уряд і тоді, і пізніше відмовився передати слобідські козацькі полки під владу гетьмана. Тим часом наближалося завершення московсько-польської боротьби за українські землі, що закінчилась «вічним миром», підписаним у Москві в 1686 р., незважаючи на всі попередження гетьмана Самойловича. Головним радником гетьмана був Мазепа, якому доручено було у січні 1686 р. передати московському уряду українське застереження і побажання. Але на долю України тоді мала вплив Москва. Це було ясним для Мазепи, який майже щороку їздив туди з різними урядовими і приватними дорученнями гетьмана. Ці подорожі й дипломатичні місії дали Мазепі дуже багато. Він не тільки мав безпосередні стосунки з московським урядом, але й зав’язував зв’язки в колах московських вельмож, зокрема на початку 1680-х років досить близько познайомився з князем Василем Голіциним, фаворитом царівни Софії Олексіївни й фактичним керівником цілої московської політики, одним з найбільш культурних людей тогочасної Московщини. Разом з тим, Мазепа проводить у Москві широкі торгівельні операції, на які потрібний був спеціальний дозвіл царського уряду. Все це давало майбутньому гетьманові досконале знання Московщини.
З часом Мазепа перетворився з небагатого гетьманського дворянина на впливового представника вищої старшини гетьманської України. В 1682 р. він став генеральним осаулом, а отже членом українського уряду і найближчим помічником гетьмана. Окрім частих дипломатичних місій до Москви, Мазепа бере участь в усіх важливих державно-політичних акціях і всіх важливих справах і подіях гетьманського двору і родини Самойловичів. Разом з політичними впливами на Україну і Москву росли й маєтки Мазепи як на Україні так і в суміжних повітах Росії.